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Detección molecular y análisis filogenético de bacterias fibrolíticas en el estómago de la llama (Lama glama)
Autor/es:
CERÓN CUCCHI M.E.; TRANGONI M.D; MARCOPPIDO G.A.; GIOFFRE A.K.; TALIA P. ; CRAVERO S.L.
Lugar:
RAPA2014
Reunión:
Congreso; 37 Congreso de la Asociacion Argentina de Produccion Animal; 2014
Institución organizadora:
RAPA
Resumen:
Introducción Las poblaciones bacterianas que habitan el contenido del compartimento 1 (C1) del estómago de los camélidos sudamericanos (CSA) conforman un ecosistema natural que incluye una alta diversidad genética con una gran variedad de funciones metabólicas que son significativamente importantes para entender la nutrición del animal. De particular relevancia son las especies bacterianas relacionadas a la degradación de fibras de origen vegetal. El C1 de la llama en particular se encuentra pobremente caracterizado, debido a las dificultades que involucra trabajar con las bacterias anaerobias estrictas que lo habitan. La aplicación de técnicas moleculares, como la prueba de reacción en cadena por la polimerasa (PCR), han demostrado utilidad para el estudio de poblaciones microbianas complejas. El objetivo de este trabajo fue detectar y caracterizar la diversidad genética de las principales especies bacterianas celulolíticas que habitan el C1 del estómago de la llama. Materiales y métodos Cuadro 1: Similitud de los clones de 16S ARNr de las genotecas Ruminococcus albus (RA), Ruminococcus flavefaciens (RF) y Fibrobacter succinogenes (FS) con aislamientos de referencia (Genbank). Genoteca N de clones / filotipos Pares de bases % de similitud Cepas de referencia (más representativas) N de GenBank (RA) 30/02 176 98/100 Ruminococcus albus V13 Ruminococcus albus 7 Ruminococcus albus JCM HQ404370 NR074399 AB531912 (RF) 35/19 835 96/99 Ruminococcus flavefaciens B146 Ruminococcus flavefaciens LB4 Ruminococcus flavefaciens NK4A78 AY445599 AY445603 GU324374 (FS) 50/05 446 96/100 Fibrobacter succinogenes OS120 Fibrobacter succinogenes S85, Fibrobacter succinogenes H23 AB275502 NR_042149 JF970205 Se utilizaron tres llamas procedentes de la provincia de Jujuy (J), alimentadas con Festuca argentinensis y cinco llamas de la provincia de Buenos Aires (BA) alimentadas con heno de alfalfa. Las muestras fueron obtenidas directamente de C1, posterior al sacrificio de las llamas de Jujuy (destinados al consumo) y mediante sonda oroesofágica de las llamas procedentes de BA. El conteo de las bacterias celulolíticas fue realizado mediante el método de número más probable (NMP). Se realizó extracción de ADN del contenido de C1 y la prueba de PCR para la detección de Ruminococcus albus (RA), Ruminococcus flavefaciens (RF) y Fibrobacter succinogenes (FS), mediante iniciadores específicos que reconocen una región de 176, 835 y 446 pb respectivamente del gen 16S ARN ribosomal (ARNr). Se construyeron genotecas para las tres bacterias detectadas, a partir del grupo de llamas con mayor capacidad celulolítica. Las secuencias obtenidas fueron comparadas con secuencias depositadas disponibles en la base de datos de GenBank del NCBI (National Center for Biotechnology Information). Con el propósito de determinar la cobertura de las genotecas se realizaron curvas de rarefacción. Además fueron calculados los índices de riqueza (Chao I y ACE) y diversidad (Shannon y Simpson). Las relaciones filogenéticas fueron inferidas mediante árboles por el método Maximum Likelihood, utilizando las secuencias de este trabajo y secuencias de referencia para cada especie identificada. Resultados y Discusión El número de bacterias anaerobias celulolíticas fue de 0,07±0,04 x 107 y 170±50 x 107 UFC/ml de C1 para las llamas de (BA) y (J) respectivamente. Mediante PCR se logró detectar a Ruminococcus albus, Ruminococcus flavefaciens y Fibrobacter succinogenes. Los fragmentos clonados y secuenciados fueron 30, 35 y 50 para las genotecas RA, RF y FS respectivamente.. Las curvas de rarefacción indicaron que el número de clones analizados fue suficiente para identificar los diferentes filotipos que componen cada una de las genotecas (RA y RF) a nivel de especie, mientras que para la genoteca FS el número de clones analizados fue suficiente a nivel de género, por lo que se necesitaría analizar un mayor número de clones para cubrir la gran diversidad de filotipos presentes a nivel de especie. El análisis de las secuencias mediante BLASTN (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) demostró que los productos de amplificación de una región parcial del gen 16S ARNr corresponden a la especificidad dada por los iniciadores empleados. Las secuencias de las genotecas muestran alta similitud a aislamientos bacterianos celulolíticos previamente reportados a partir de otras especies animales (Cuadro 1). Estos resultados están en congruencia con los obtenidos en los árboles filogenéticos. Conclusiones Este es el primer trabajo en proveer información respecto a la cuantificación, detección y diversidad genética de bacterias celulolíticas a partir del C1 de la llama. La población microbiana fue más fibrolítica en el C1 de las llamas de Jujuy con respecto a las llamas de Buenos Aires.
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